>1. Jakie białka cytozolowe należy ze sobą połączyć( MECHANIZM SELEKCJI), czyli w naszym >przypadku białko hsp i potencjalne białko mitochondrialne?

O co chodzi z "połączeniem" białek?
Nie są łączone, normalna translacja na terenie cytozolu. Jeżeli na początku białka jest specjalna sekwencja aminokwasów, przyłączane jest takie białko do receptora w błonie mitochondrium i "nasadzane" na kanał translokazy.
Translokaza składa się z zespołu białek o różnych numerkach, w zależności od typu sekwencji, wsuwane jest do różnych przedziałów mitochondrium, przez różne białko translokazy.
Cała informacja tkwi w sekwencji aminokwasów.

>2. Kiedy ma dokonać tego połączenia, czyli stworzenia specyficznego kompleksu?
Po zakończeniu translacji. Czyli kiedy tylko białko będzie gotowe.

>3. W jakim kierunku ten kompleks ma być transportowany, aby dotrzeć do mitochondrium?
Wydaje się że translacja zachodzi na obszarach cytozolu w sposób nieprzypadkowy. A więc mRNA transportowane jest wzdłuż mikrotubul do odpowiedniego obszaru. Wydaje się, że taka regulacja zwiększa szybkość dotarcia później białek do właściwych miejsc.

Ale nawet jeśli translacja przebiegłaby gdziekolwiek, w komórce nie ma aż tak dużo miejsca, więc białko będzie sobie pływać do momentu napotkania właściwego sobie zestawu białek.
Przypomnę, że mitochondria są dość liczne - od kilku, przez kilkaset, a nawet do 500.tys (u ameby o wdzięcznej nazwie Chaos). Szanse na trafienie są spore.

Dziękuję Pani Aniu za merytoryczną odpowiedź.

>O co chodzi z "połączeniem" białek?
>Nie są łączone, normalna translacja na terenie cytozolu.

Chyba byłem niezbyt precyzyjny. Chodzi mi o to, że po translacji specyficznych białek tzn. mitochondrialnych, zostają nastepnie do nich dołączone specyficzne białka opiekuńcze: Hsp70 i Hsp90
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3057322/
Cytat:
Te białka są istotne dla transportu do mitochondrium, bo wiążą się specyficznie z receptorem obecnym z zewnętrznej błonie mitochondrialnej ( kompleks Tom70).
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12526792/
Nasuwają mi się takie pytanie:
Skąd komórka czerpie informacje o tym, że po translacji określonej grupy białek mają do nich zostać dołączone białka Hsp70 i Hsp90?

Jeśli weźmiemy do analizy organizm modelowy Saccharomyces cerevisiae, to mamy do czynienia z milionami makrocząsteczek różnych rodzajów, które dynamicznie dyfundują w różnych kierunkach. Panuje tam ogromne zagęszczenie i nie ma tam miejsca na swobodną dyfuzję, ale nieustane specyficzne i niespecyficzne interakcje. Proces ten nazywa się macromolecular crowding en.wikipedia.org/wiki/Macromolecular_crowding , co ładnie widać tutaj: en.wikipedia.org/wiki/File:Crowded_cytosol.png
Czy białko Hsp90 jest zdeterminowane, aby wiązać się tylko z białkami mitochondrialnymi? Bynajmniej. Bierze ono udział w przyspieszaniu fałdowania, zapobieganiu agregacji/degradacji przede wszystkim wielu innych białek np. związanych z transkrypcją, cyklem komórkowym itd
Cytat:
www.yeastg(*)-bin/locus.fpl?dbid=S000004798

Białko Hsp90 wchodzi w interakcje z ponad 1000 różnych białek, a tylko nieliczne to mitochondrialne.
thebiogrid.org/35364
Musi zatem istnieć proces integracji, polegający na selekcji przez komórkę z jakimi białkami ma się wiązać specyficznie Hsp90. Nie jest to dziwne, bo białka tego jest bardzo dużo, bo ponad 130000, i mogłoby ono wchodzić w niespecyficzne, szkodliwe oddziaływania z innymi białkami. Widać z tego, że wiekszość białek mitochondrialnych nie jest wspierana przez Hsp90, czyli co umożliwia im osiągnięcie odpowiedniej konformacji warunkującej związanie z receptorem mitochondrialnym?

>Wydaje się że translacja zachodzi na obszarach cytozolu w sposób nieprzypadkowy. A więc mRNA transportowane jest wzdłuż mikrotubul do odpowiedniego obszaru. Wydaje się, że taka regulacja zwiększa szybkość dotarcia później białek do właściwych miejsc.

Taki proces rzeczywiście ma miejsce, czyli kotranslacyjna synteza białka na błonie mitochondrialnej, zatem podobnie jak w transporcie do ER.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3153978/
Na razie nie wiadomo na ile jest to powszechne, bo dowody dotyczą nielicznych białek w ten sposób transportowanych. Autorzy niestety nie wyjasniają mechanizmu tego procesu, a tym bardziej sposobu rekrutacji mitochondrialnego m-RNA do błony mitochondrialnej.
>Ale nawet jeśli translacja przebiegłaby gdziekolwiek, w komórce nie ma aż tak dużo miejsca, więc białko będzie sobie pływać do momentu napotkania właściwego sobie zestawu białek.

Przypominam o zjawisku macromolecular crowding. To moim zdaniem, nie tyle białka mitochondrialne sobie pływają, aż spotkają właściwy sobie zestaw białek, ale odpowiednie białka są dostarczane do białek mitochondrialnych.

>Jeżeli na początku białka jest specjalna sekwencja aminokwasów, przyłączane jest takie białko do receptora w błonie mitochondrium i "nasadzane" na kanał translokazy.

Wykonałem wysiłek, i przeanalizowałem bazę www.unipro(*)yword/?query=taxonomy:559292
Spośród 747 białek mit.drożdż niecałe 50% zawiera sekwencję kierującą ( transit peptide).
www.unipro(*)my:559292 keyword:496#9994
Co ciekawe, i sprzeczne z tym, co wielu uważa, białka nie posiadające sekwencji kierującej trafiają jednak do mitochondrium, a potem do ich specyficznych przedziałów. Spośród 69 białek błony zewnętrznej, tylko jedno miało sekwencję kierującą. Jak zatem one trafiają do mito?
www.unipro(*)d:496 keyword:809#9998,496

>Wykonałem wysiłek, i przeanalizowałem bazę www.unipro(*)yword/?query=taxonomy:559292
>Spośród 747 białek mit.drożdż niecałe 50% zawiera sekwencję kierującą ( transit peptide).

Nazbyt uogólniłeś wynik swojej analizy. W rzeczywistości 50% drożdżowych białek mitochondrialnych w bazie uniprot miało przypisany "transit peptide". To nie znaczy, że reszta go nie ma. Być może go nie zidentyfikowano lub nie ma go przypisanego w bazie uniprot.

>Skąd komórka czerpie informacje o tym, że po translacji określonej grupy białek mają do nich zostać dołączone białka Hsp70 i Hsp90?

Białka HSP70 i HSP90 wiążą się ze wszystkimi lub niemal białkami. Jest to związane z ich najwcześniej wykrytą funkcją zawartą w nazwie HSP - heat shock proteins (białka szoku cieplnego).

W przypadku szoku cieplnego dochodzi do rozwijania się białek pod wpływem zwiększonej temperatury, a rozwinięte białka mogą się "zlepiać" ze sobą w sposób nieodwracalny - utrata ważnych białek i złogi agregatów białkowych. Dlatego podwyższenie temperatury ponad "standardową" indukuje ekspresję białek szoku cieplnego, które wiążą się z rozwiniętymi białkami, stanowiąc dla nich bufor zabezpieczający przed agregacją i wytrącaniem.

Ale białka te (zwłaszcza HSP90) są produkowane w sposób konstytutywny w komórkach, gdyż nawet bez szoku cieplnego pomagają powstającym w procesie translacji białkom w zwijaniu się. Stąd są też są nazywane białkami opiekuńczymi (ang. chaperones).

Białka to łańcuchy reszt aminokwasowych, z których część jest hydrofilowa (chętniej oddziałuje z wodą) a część hydrofobowa (podobna do tłuszczu, chętniej oddziałuje z innymi substancjami hydrofobowymi). Kropla tłuszczu w wodzie tworzy zwartą formę kulistą lub soczewki na powierzchni wody - nie mieszają się. Po translacji łańcuch białkowy zwija się w ten sposób, że generalnie reszty hydrofobowe "zwierają się" do środka (podobnie jak kropla tłuszczu), a reszty hydrofilowe są eksponowane na zewnątrz. W ten sposób powstaje białko zwinięte - natywne, funkcjonalne.

Mechanizm działania białek HSP jest dość dobrze opisany. W przypadku białka HSP90 na skutek hydrolizy ATP zmienia ono konformację na "otwartą" - eksponuje reszty hydrofobowe, umożliwiając wiązanie się do niego białek niezwiniętych, w których reszty hydrofobowe są również eksponowane (następuje przyleganie do siebie reszt hydrofobowych) i powstania formy zamkniętej HSP w kompleksie z innym białkiem. Kolejna hydroliza ATP powoduje znów powstanie formy otwartej HSP90 i uwolnienie przyłączonego białka.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8420964
www.jbc.org/content/272/12/8007.long

Białka HSP mogą się ponadto wiązać z innymi białkami w inny sposób, niż hydrofobowy, np. z licznymi kinazami czy białkami z modułem TPR. W tym przypadku HSP oddziałuje poprzez hydrofilowe reszty znajdujące się na powierzchni. HSP90 ma dużą liczbę białek wiążących w ten sposób, ale oprócz tego może wiązać praktycznie każde białko znajdujące się w formie rozwiniętej, którego reszty hydrofobowe są w naturalny sposób eksponowane.

Białka mitochondrialne są więc już na wstępie, po translacji, związane z HSP70/90. Ich dostarczanie do zewnętrznej błony mitochondrialnej jest zapewne związane z tym, że białka mitochondrialne nie potrafią się zwinąć w cytozolu, a forma rozwinięta jest buforowana przez cykliczne wiązanie z HSP. I tak się dzieje do momentu rozpoznania sekwencji przez białko na powierzchni mitochondrium, a dalej następuje translokacja przez błonę (jedną lub dwie), po czym białko może już ulec poprawnemu zwinięciu i być funkcjonalne.

Dodatkowo wiązanie się białek HSP do białek zewnętrznej błony mitochondrialnej ułatwia znalezienie się białka mitochondrialnego, którego forma rozwinięta jest wiązana przez HSP, w pobliżu receptora sekwencji transportu do mitochondrium.

>Nazbyt uogólniłeś wynik swojej analizy. W rzeczywistości 50% drożdżowych białek mitochondrialnych w bazie uniprot miało przypisany "transit peptide". To nie znaczy, że reszta go nie ma. Być może go nie zidentyfikowano lub nie ma go przypisanego w bazie uniprot.

Dziękuję Michale za merytoryczną odpowiedź.
Nie zidentyfikowano w bazie uniprot sekwencji kierującej "transit peptide", bo widocznie jej tam nie ma. To nie jest kwestia bazy, ale programów, które analizują takie sekwencje. Zostało to zbadane na kilku tysiącach sekwencji i przy pomocy kilku programów www.orobor(*)/Neupert_and_Herrmann_2007.pdf str.3
Jednym z nich jest TargetP o 90% skuteczności w przewidywaniu "transit peptide"
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10891285
Dzisiaj już nie ma wątpliwości, że wiele białek mitochondrialnych nie ma "transit peptide" , a czy to będzie 50% czy 30% to już jest kwestia drugorzędna, bo to i tak jest kilkaset makrocząsteczek. Baza uniprot zawiera ok 750 białek mitochondrialnych, z których ok 350 nie zawiera "transit peptide". Jak znasz inną bazę, która pokazuje coś drastycznie innego np. tylko kilkadziesiąt białek mit. nie zawiera "transit peptide", to z chęcią ją poznam, bo dotychczas takiej nie znalazłem.
Wniosek: są białka, które nie mają transit peptide, a mimo to znajdują się w mitochondrium.
Pytanie: jak one tam trafiają?

>Białka HSP70 i HSP90 wiążą się ze wszystkimi lub niemal białkami.
Z tego co wiem, to te białka nie spełniają tego warunku, ale o tym za chwilę.
To jest ważna kwestia warta uwagi. Znalazłem interesujący artykuł w prestiżowym Nature Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms www.sfb746(*)/2012/Pfanner/schmidt_2010.pdf
Autorzy artykułu twierdzą i dowodzą, że o skuteczności transportu białek do mit. decyduje:

1. Specyficzne wiązanie białek mitochondrialnych z Hsp70 i Hsp90
2. Transport takiego kompleksu do błony mitochondrialnej i wiązanie jego z receptorami w niej zawartymi.

Pozwolę sobie wejść z tymi tezami wejść w polemikę.
Ad.1. Białko Hsp 90 jest b.liczne u drożdży i stanowi 1-2% wszystkich białek. Pomimo tego, wchodzi ono w specyficzną interakcję z ok 1040 białek, czyli mniej niż 20%. thebiogrid.org/35364 Tak przynajmniej jest w znakomitej bazie BioGRID 3.2. Co więcej, i to jest istotne, tylko część z nich stanowią białka mitochondrialne. Nie wiem dokładnie ile ich jest, ale przeanalizowałem, czy białko Hsp90 wchodzi w interakcję i z iloma białkami rybosomalnymi. Znalazłem tylko 3 spośród 50 białek rybosomalnych (MRPs), czyli mniej niż 10%!
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9445368
Widać zatem, że MRPs nie wiążą się z Hsp90, czyli jak mogą być transportowane?
Ad.2. Receptory w błonie mit.( mitochondrion targeting sequence binding) to 5 białek:
www.yeastg(*)gi-bin/GO/goTerm.pl?goid=30943
Prawdą jest, że wchodzą one w interakcję z Hsp70/90, czyli są lub mogą być receptorami dla nich. Tym niemniej białka receptorowe wchodzą w specyficzne interakcje z wieloma białkami. Np. kluczowy receptor Tom70 aż z 158 białkami:
thebiogrid.org/35706
Warto zwrócić uwagę, że są to białka rezydujące w różnych przedziałach komórkowych, czyli same związanie z receptorem nie determinuje, gdzie dane białko ma się znajdować.
Zatem: skoro niemal wszystkie białka ryboSomalne MRP nie wiążą się z Hsp90, to może one trafiają bez jego pośrednictwa i wiążą się BEZPOSREDNIO z receptorem Tom70? Sprawdziłem to tutaj: thebiogrid.org/35706
Wniosek: żadne MRPs nie wiążą się z Tom70.
Oczywiście, nie wszystko sprawdziłem np. czy HSP70/90 wchodzi w interakcję i z iloma innymi białkami mit i czy inne receptory mitochondrion targeting sequence binding, a jest ich 4 potrafią związać jakieś białka mitochondrialne, ale to już innym razem.

>Białka mitochondrialne są więc już na wstępie, po translacji, związane z HSP70/90.

Z tego co przedstawiłem, to choćby w przypadku MRP taka sytuacja nie ma miejsca.
>Ich dostarczanie do zewnętrznej błony mitochondrialnej jest zapewne związane z tym, że białka mitochondrialne nie potrafią się zwinąć w cytozolu, a forma rozwinięta jest buforowana przez cykliczne wiązanie z HSP.

Jakieś dane naukowe? Dla mnie jest to wysoce niejasne. Czy Hsp pomagają się białku rozwinąć, aby transit peptide był dostępny dla receptorów błony mit., czy też przyspieszają ich zwijanie?

>I tak się dzieje do momentu rozpoznania sekwencji przez białko na powierzchni mitochondrium, a dalej następuje translokacja przez błonę (jedną lub dwie), po czym białko może już ulec poprawnemu zwinięciu i być funkcjonalne.
>Dodatkowo wiązanie się białek HSP do białek zewnętrznej błony mitochondrialnej ułatwia znalezienie się białka mitochondrialnego

Tylko, że np.Hsp90 wiąże się nie tylko z b.mit., ale też z innymi, a one jednak nie trafiają do mitochondrium. Swoją drogą ciekawi mnie, czy analizowano przy pomocy programów np. TargetP wszystkie białka drożdży pod katem posiadanie przez nich "transit peptide"?

'

>Nie zidentyfikowano w bazie uniprot sekwencji kierującej "transit peptide", bo widocznie jej tam nie ma. To nie jest kwestia bazy, ale programów, które analizują takie sekwencje.

Programy służą przewidywaniu sekwencji sygnalnych na podstawie dostępnych danych. Wynik przewidywania może być prawdziwy, ale też może być fałszywie negatywny lub fałszywie pozytywny.

Czy dane białko mitochondrialne zawiera sekwencję sygnalną należałoby potwierdzić eksperymentalnie. Analiza bioinformatyczna to za mało.

Wniosek, jakoby brak przypisu "transit peptide" w bazie danych białkowych lub brak identyfikacji przy pomocy programu do przewidywania oznaczało, że nie ma jakiejkolwiek sekwencji sygnalnej jest znacznie zbyt daleko idący i nieuprawniony.

Nie wierzę, żeby dla wszystkich 750 białek mitochondrialnych drożdży przeprowadzono weryfikację eksperymentalną. Prawdopodobnie została wykonana tylko dla małej części z tych białek. Dla innych przewidziano na postawie algorytmów i razem wyszło Ci 350. A pozostają jeszcze przecież nie dodane do bazy informacje.

> Jak znasz inną bazę, która pokazuje coś drastycznie innego np. tylko kilkadziesiąt białek mit. nie zawiera "transit peptide", to z chęcią ją poznam, bo dotychczas takiej nie znalazłem.

Naprawdę sądzisz, że w tej bazie lub np. bazach NCBI znajdziesz wszystkie naukowe i opublikowane informacje przypisane do odpowiednich rekordów? Ja rutynowo z nich korzystam i znajduję liczne informacje w nich nieobecne. Nie da się po prostu dopisywać wszystkiego.

I czy naprawdę uważasz (a mam takie wrażenie), że jak w bazie uniprot lub innej nie znajdziesz wpisu np. o oddziaływaniu białka X z białkiem Y, to tego oddziaływania być nie może? Jeśli mielibyśmy wpis o negatywnym wyniku eksperymentalnej weryfikacji - rozumiem. Ale brak wpisu najprawdopodobniej oznacza, że tego nie badano.

>Dzisiaj już nie ma wątpliwości, że wiele białek mitochondrialnych nie ma "transit peptide"(...)

A znajdziesz mi w publikacji naukowej takie stwierdzenie? W przedstawionych przez Ciebie artykułach takich wniosków nie ma (być może nie zauważyłem).

Za to jest np: Cytat:
Czyli, sekwencja sygnalna może być N-końcowa lub wewnętrzna.

>Jednym z nich jest TargetP o 90% skuteczności w przewidywaniu "transit peptide"

Program ten analizuje tylko sekwencje N-końcowe. A precyzyjniej mówiąc, lokalizuje nie tyle sekwencje tranzytowe, co miejsca cięcia dwóch proteaz: Cytat: Wewnętrznych sekwencji sygnalnych nie bierze pod uwagę, ponieważ nie podlegają one cięciu proteazami.

>>Białka HSP70 i HSP90 wiążą się ze wszystkimi lub niemal białkami.
>Z tego co wiem, to te białka nie spełniają tego warunku, ale o tym za chwilę.

Mam nieodparte wrażenie, że mylisz "specyficzne" wiązanie z chaperonami HSP70/90 z wiązaniem białek w formie niezwiniętej. Gdyby te chaperony nie były w stanie wiązać białek "jak leci", to byle stres cieplny powodowałby śmierć komórki na skutek masowego wytrącania się zdenaturowanych białek.
Chaperonowa funcka HSP jest zupełnie podstawowa dla komórki. Stąd np. szkodliwość inhibitorów aktywności ATPazowej HSP90.

Innym przykładem procesu, w którym HSP90 wiąże niespecyficznie ("jak leci") białka rozwinięte jest translokacja antygenów zewnątrzkomórkowych z endosomów do cytosolu:
www.pnas.org/content/108/39/16363.long

W artykule podanym przez Ciebie rola HSP jest podana jasno:
Cytat:
Fig. 2 w tej publikacji daje jasne odpowiedzi na zadawane przez Ciebie pytania. Podobnie jak przeglądówka Neaupert i Hermann (też przez ciebie zalikowana).

>Jakieś dane naukowe? Dla mnie jest to wysoce niejasne. Czy Hsp pomagają się białku rozwinąć, aby transit peptide był dostępny dla receptorów błony mit., czy też przyspieszają ich zwijanie?

Każde białko zaraz po translacji jest rozwinięte i (poza przypadkami białek szybko się zwijających) ulega wiązaniu z jakimś chaperonem, aby je zabezpieczyć przed agregacją z innymi rozwiniętymi białkami.

Dane naukowe masz w podanych przez Ciebie artykułach.

>Tylko, że np.Hsp90 wiąże się nie tylko z b.mit., ale też z innymi, a one jednak nie trafiają do mitochondrium.

Ponieważ nie mają sekwencji (N-końcowych lub wewnętrznych), które są rozpoznawane przez translokazy mitochondrialne.

Jeszcze raz na podsumowanie powtórzę - na wszystkie zadawane przez Ciebie pytania są odpowiedzi w artykułach przez Ciebie linkowanych.

>Programy służą przewidywaniu sekwencji sygnalnych na podstawie dostępnych danych. Wynik przewidywania może być prawdziwy, ale też może być fałszywie negatywny lub fałszywie pozytywny.

Zgadza się. Tylko, że program targetP ma wysoką przewidywalność w zakresie związku między sekwencją sygnalną a lokalizacją w mitochondrium - ok 90%. Program bada w oparciu o algorytm sieci neuronowych, czy dane białko ma czy nie ma sekwencji sygnalnej.Jeśli ma, to powinien być w mitochondrium, jeśli nie ma, to w innym przedziale komórkowym. Udaje mu się ten związek( sek.syg. a lokalizacja w mitochondrium) uzyskać z 90% skutecznością, ergo taki związek istnieje. Sekwencje sygnalne opracowano na podstawie analizy N-sekwencji kilkuset białek mitochondrialnych. Moim zdaniem program wykazał się skutecznością i dowiódł istnienia określonej, specyficznej N-sekwencji.

>Czy dane białko mitochondrialne zawiera sekwencję sygnalną należałoby potwierdzić eksperymentalnie.

I tak zrobiono. Najpierw znaleziono eksperymentalnie białka w mitochondrium, przebadano i ustalono ich N-sekwencję, a na podstawie tego w oparciu o algorytm stworzono tak skuteczny program. Takie są fakty.

>Analiza bioinformatyczna to za mało.

Analiza bioinformatyczna to narzędzie do ich opracowaniu, ustalenia, rozwiązania problemów biologicznych, a w naszym przypadku sekwencji sygnalnej. Narzedzie w postaci programu targetP, moim zdaniem, znakomicie się do tego nadaje.

>Wniosek, jakoby brak przypisu "transit peptide" w bazie danych białkowych lub brak identyfikacji przy pomocy programu do przewidywania oznaczało, że nie ma jakiejkolwiek sekwencji sygnalnej jest znacznie zbyt daleko idący i nieuprawniony.

Wniosek taki jest uprawniony z 90% prawdopodobieństwem, czy jak kto woli skutecznością. To mało? Nie jakakolwiek sekwencja sygnalna warunkuje wejście do mitochondrium ,ale specyficzna, którą znakomicie przewiduje program TargetP.
Predicting protein subcellular
localisation from amino acid
sequence information STR.4
www.google(*)Z2KQLAig&bvm=bv.46340616,d.Yms
>Nie wierzę, żeby dla wszystkich 750 białek mitochondrialnych drożdży przeprowadzono weryfikację eksperymentalną. Prawdopodobnie została wykonana tylko dla małej części z tych białek.

To nieporozumienie. To, czy dana sekwencja jest lub nie sek.syg. bada się na podstawie analizy eksperymentalnie potwierdzonych białek mitochondrialnych.

>Dla innych przewidziano na postawie algorytmów i razem wyszło Ci 350.

Nie wiem, o jakie bazy Ci chodzi i jaki to ma związek z sekwencjami sygnalnymi? Uniprot ma ok 750 białek mitochondrialnych i badając je przy pomocy programu targetP O 90% skuteczności, znaleziono ich ok 400. To mało? Ok 350 nie miało specyficznej sekwencji sygnalnej zbudowanej w oparciu o ten skuteczny algorytm programu targetp. Może te białka mają jakąś inną, również specyficzną sekwencję sygnalną? Może, ale to na razie kwestia wiary, a nie wiedzy, opartej na badaniach naukowych. Nie znalazłem w dostępnej mi literaturze rozwiązania tego problemu, czyli określenia eksperymentalnie hipotetycznej( alternatywnej) sekwencji sygnalnej. Nie znalazłem jakiegokolwiek, nawet o niskiej skuteczności, programu przewidującego taką alternatywną sekwencję sygnalną. Jeśli posiadasz jakieś wiedzę na ten temat, to z chęcią ją poznam. Może trzeba dzisiaj uznać, że nie ma innej, alternatywnej, specyficznej N-sekwencji.

>A pozostają jeszcze przecież nie dodane do bazy informacje.

Chodzi Ci o to chyba, że białek mit. jest ok 1000, a uniprot zaw. ich 750. To niewiele zmienia, bo i tak pozostaje przynajmniej 350 białek pozbawionych specyficznej sek.syg.

>Naprawdę sądzisz, że w tej bazie lub np. bazach NCBI znajdziesz wszystkie naukowe i opublikowane informacje przypisane do odpowiednich rekordów?

A co to ma do rzeczy? Żadna baza nie posiada wszystkich informacji, ale w oparciu o niekompletne informacje, wyciąga się wnioski. Nauka i naukowcy nie posiadają wszystkich informacji. Zawsze dokonują uogólnień, ekstrapolacji. w naszym przypadku, bo chyba chodzi Ci o sek.syg., program bazuje na licznej próbce, i co więcej jest skuteczny, bo 90% to wynik, jakim wiele programów analizujących podobne problemy nie może się poszczycić.
>Ja rutynowo z nich korzystam i znajduję liczne informacje w nich nieobecne. Nie da się po prostu dopisywać wszystkiego.

To prawda. Działamy w oparciu o ograniczoną wiedzę. Artykułu naukowe na takiej są oparte.

>I czy naprawdę uważasz (a mam takie wrażenie), że jak w bazie uniprot lub innej nie znajdziesz wpisu np. o oddziaływaniu białka X z białkiem Y, to tego oddziaływania być nie może? Jeśli mielibyśmy wpis o negatywnym wyniku eksperymentalnej weryfikacji - rozumiem.

Może być takie oddziaływanie, ale powtarzam: działamy w oparciu o aktualny stan wiedzy, a nie co może być lub kiedyś zostanie odkryte.

> Ale brak wpisu najprawdopodobniej oznacza, że tego nie badano.

Skąd wiesz, że nie badano w bazie BioGRID 3.2 specyficznych interakcji np. białka Hsp 90 z innymi białkami , niż te, które tam przedstawiono, czyli ok 1000? Możesz przedstawić inną, bogatszą bazę. Zresztą powtarzam: naukowcy piszą artykuły w oparciu o dostępne informacje w różnych w bazach. Jeśli w dostepnych bazach czy badaniach nie ma np. takich interakcji, to zgodnie z dzisiejszym stanie wiedzy, nie znamy takich interakcji ergo takich interakcji nie ma, choć może kiedyś takie odkryjemy, co cały czas ma miejsce. W przypadku np. Hsp90 odkryto i odkrywa się nowe interakcje, ale białka mit. to niewielki procent, choć konkretnych danych nie ma, ale podałem, ile białek ryb. posiada takowe. Może odkryją nowe, ale dzisiaj ich nie ma, i póki nie będzie, nie ma co spekulować i dokonywać nieuprawnionych ekstrapolacji.
>Dzisiaj już nie ma wątpliwości, że wiele białek mitochondrialnych nie ma "transit peptide"(...)
>A znajdziesz mi w publikacji naukowej takie stwierdzenie? W przedstawionych przez Ciebie artykułach takich wniosków nie ma (być może nie zauważyłem).
>Za to jest np: Cytat:

Cytosolic precursors of mitochondrial proteins contain information that is necessary and sufficient to direct them to the mitochondria. In most cases, this information is present as a cleavable sequence at the N terminus, also called presequence or prepeptide. However, many precursors lack such sequences and instead contain internal targeting signals.
>www.orobor(*)/Neupert_and_Herrmann_2007.pdf

To zachęcam Cię to uważnego czytania artykułu.
Autorzy stwierdzają w oparciu o dane z programów np. targetP, że sekwencje syg. istnieją. Z tym się zgadzam.
Stwierdzają również ,że wiele białek nie zawiera N-sekwencji sygnalnej:
Cytat: (str4)

W przypadku drożdży to jest ok 350 białek, ale pewnie jest ich więcej, bo nie ma w bazie uniprot ok 250 białek.

>Czyli, sekwencja sygnalna może być N-końcowa lub wewnętrzna.

W przypadku istnienia specyficznej sekwencji wewnętrznej, to bardziej postulat niż wynik badań eksperymentalnych. Nie znamy żadnego spójnego wzoru np. specyficznych aminokwasów. Charakter tej sekwencji jest nieuchwytny.
Cytat: str.4
Nie opracowano, o ile wiem, jakiegokolwiek programu nawet, o niskiej skuteczności, przewidującego taką sekwencję. Ta bliżej nieokreślona sek.wew. wpływa na transport wewnątrz mit:
Cytat:

Niestety, ale nie znamy jaki rodzaj sekwencji decyduje o tym, w jakim przedziale, a jest ich 4, ma się znaleźć konkretne białko.

>Program ten analizuje tylko sekwencje N-końcowe. A precyzyjniej mówiąc, lokalizuje nie tyle sekwencje tranzytowe, co miejsca cięcia dwóch proteaz: Cytat:

NOTE 1: TargetP uses ChloroP and SignalP to predict cleavage sites for cTP and SP, respectively.www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

Wewnętrznych sekwencji sygnalnych nie bierze pod uwagę, ponieważ nie podlegają one cięciu proteazami.

Częściowo się mylisz. TargetP jak najbardziej lokalizuje sek.tranzytowe
Cytat:
jak i miejsca cięcia proteaz:
Cytat:

>Mam nieodparte wrażenie, że mylisz "specyficzne" wiązanie z chaperonami HSP70/90 z wiązaniem białek w formie niezwiniętej. Gdyby te chaperony nie były w stanie wiązać białek "jak leci", to byle stres cieplny powodowałby śmierć komórki na skutek masowego wytrącania się zdenaturowanych białek.

Moim zdaniem się mylisz, przynajmniej jeśli chodzi o Hsp90. Większość białek drożdży w normalnych warunkach nie wymaga Hsp90( u drożdży nazywa się Hsp82)
Cytat:

W normalnych warunkach wymagają np. kinazy czy czynników transkrypcyjne.

>Chaperonowa funcka HSP jest zupełnie podstawowa dla komórki. Stąd np. szkodliwość inhibitorów aktywności ATPazowej HSP90.

Nie mówimy o rolo Hsp90 w komórce, ale o roli w transporcie do mit. Nie udowodniono, że białko to bierze udział w transporcie wszystkich białek mit. Baza BioGRID pokazuje dzisiaj, że większość białek mit. nie wchodzi w specyficzne interakcje z Hsp90, to jak to białko może brać udział w ich transporcie? To białko pomaga prawidłowo sfałdować się wielu białkom, ale w normalnych warunkach tylko części mitochondrialnych. Co więcej: to, że im pomaga w tym procesie, nie oznacza, że ma zdolność do transportu ich do mitochondrium, nie mówiąc o transporcie większości pozostałych białek mit.
Białka Hsp są niezbędne w komórce, ale jest ich wiele, nie tylko hsp70/90.
www.yeastg(*)-bin/GO/goTerm.pl?goid=0051082
Tamte jednak nie biorą udziału w transporcie do mit.- dlaczego, skoro część z nich to cytoplazmatyczne białka?

>W artykule podanym przez Ciebie rola HSP jest podana jasno:
>Cytat:

Cytosolic chaperones (such as Hsp70) prevent aggregation of the precursors. The receptor Tom70 possesses binding sites for precursors and chaperones. After translocation through Tom40, the precursors are transferred by the Tim9-Tim10 chaperone through the intermembrane space.www.sfb746(*)/2012/Pfanner/schmidt_2010.pdf

>Fig. 2 w tej publikacji daje jasne odpowiedzi na zadawane przez Ciebie pytania. Podobnie jak przeglądówka Neaupert i Hermann (też przez ciebie zalikowana).

No właśnie nie wyjaśnia i nie dowodzi:
- czy i dlaczego Hsp70/90 wiąże się ze wszystkimi białkami mit? Z bazy BioGrid wynika znikoma ilość białek mit. wchodzących w specyficzne int. z Hsp90.
- nie dowodzi, że Hsp70/90 pełni rolę białka transportowego, ale tylko, że zapobiega agregacji i sprzyja prawidłowemu fałdowaniu?
Białka transportowe istnieją w komórce i są to np. importyny w transporcie jąd.-cyt.:
www.ecs.umass.edu/~mettu/ece597m/readings/ming-
wen/Structural%20Biology%20of%20Nucleocytoplasmic%20Transport.pdf
- nie wyjaśniono w jaki sposób/mechanizm/, Hsp70/90 w hipotetycznym kompleksie z białkiem mit. odnajduje drogę do mitochondrium? Komórka jest totalnie zagęszczona makrocząsteczkami, jest wiele błon, receptorów itd.

>Każde białko zaraz po translacji jest rozwinięte i (poza przypadkami białek szybko się zwijających)

Czyli nie każde, ale część i to też nie zawsze, ale np. w warunkach stresu.

>ulega wiązaniu z jakimś chaperonem, aby je zabezpieczyć przed agregacją z innymi rozwiniętymi białkami.

No właśnie: z jakim chaperonem mają się wiązać białka mitochondrialne, skoro jest ich tak wiele w cytoplazmie?
>Dane naukowe masz w podanych przez Ciebie artykułach.

Dane naukowe tego nie wyjaśniają, a przynajmniej ja nie znalazłem.

>>Tylko, że np.Hsp90 wiąże się nie tylko z b.mit., ale też z innymi, a one jednak nie trafiają do mitochondrium.
>Ponieważ nie mają sekwencji (N-końcowych lub wewnętrznych), które są rozpoznawane przez translokazy mitochondrialne.

Tylko nie wyjaśniasz i nie dowodzisz, czy i dlaczego z białkami mit. ma się wiązać Hsp70/90? Hsp70/90 wiąże się tylko do niektórych białek mit. Hsp70/90 nie jest białkiem receptorowym, czyli nie wiąże się do ich sek.syg. Po związaniu się z niektórymi białkami mit. i bliżej niewyjasnionym transporcie rzeczywiście wiąże się do receptora w zew.błonie mit. Tylko, że może dostarczyć do niego białka niemitochondrialne, do których też się wiąże i to w dużym procencie. Coś musi rozfałdować to białko mit., bo sek.sygg. jest ukryta. W transporcie do ER jest to zrozumiałe, bo tylko z fragmentem białka wiąże się specyficzny receptor do sek. syg.( SRP) ( hSP NIE JEST RECEPTOREM) i taki kompleks jest dostarczany do ER. SRP po związaniu z receptorem ER, nastepuje transport białka. Nie ma problemu, że sek.syg. jest ukryta w całym białku.

>Tylko, że program targetP ma wysoką przewidywalność w zakresie związku między sekwencją sygnalną a lokalizacją w mitochondrium - ok 90%.
>Sekwencje sygnalne opracowano na podstawie analizy N-sekwencji kilkuset białek mitochondrialnych. Moim zdaniem program wykazał się skutecznością i dowiódł istnienia określonej, specyficznej N-sekwencji.

Wspomniany program porównuje N-końcowe sekwencje białkowe ze zweryfikowanymi N-końcowymi sekwencjami kierującymi do mitochondrium. Nie mógł on zatem "dowieść istnienia określonej, specyficznej N-sekwencji"! To by było błędne koło, ponieważ program ten bazuje na istnieniu takich sekwencji w znanych białkach!

Program ten może nam jedynie pomóc przewidzieć, czy nasze badane białko/białka może mieć lokalizację mitochondrialną.

>>>Wniosek, jakoby brak przypisu "transit peptide" w bazie danych białkowych lub brak identyfikacji przy pomocy programu do przewidywania oznaczało, że nie ma jakiejkolwiek sekwencji sygnalnej jest znacznie zbyt daleko idący i nieuprawniony.
>Wniosek taki jest uprawniony z 90% prawdopodobieństwem, czy jak kto woli skutecznością.

No nie, bo program nie analizuje wewnętrznych sekwencji kierujących do mitochondrium. Przykłady lokalizacji białek w mitochondrium poprzez sekwencje wewnętrzne w poście powyżej.

>Skąd wiesz, że nie badano w bazie BioGRID 3.2 specyficznych interakcji np. białka Hsp 90 z innymi białkami , niż te, które tam przedstawiono, czyli ok 1000?

No właśnie nie wiem, bo nie ma tam wpisów o eksperymentalnym stwierdzeniu braku oddziaływania. A brak oddziaływania w określonych warunkach jest jak najbardziej weryfikowalny, chociażby jako brak obecności w immunoprecypitacie pomimo obecności białka w próbce przed immunoprecypitacją oraz obecność we frakcji niezwiązanej. Czasami wynik może być niejednoznaczny - wówczas również nie wiadomo.

Jeśli nigdzie nie ma informacji o danym oddziaływaniu lub jego braku, to oznacza, że tego nie wiadomo, a nie, że tego oddziaływania nie ma.

Kwestia ta jest o tyle ważna, ponieważ wyciągasz z tego pochopne wnioski, np:
>Nie wiem dokładnie ile ich jest, ale przeanalizowałem, czy białko Hsp90 wchodzi w interakcję i z iloma białkami rybosomalnymi. Znalazłem tylko 3 spośród 50 białek rybosomalnych (MRPs), czyli mniej niż 10%!
>Widać zatem, że MRPs nie wiążą się z Hsp90, czyli jak mogą być transportowane?

Brak infomacji w bazie = HSP nie bierze udziału. Tego po prostu dla tych białek nie wiadomo. Jest to weryfikowalne, ale do tej pory nie wiadomo.

>Wspomniany program porównuje N-końcowe sekwencje białkowe ze zweryfikowanymi N-końcowymi sekwencjami kierującymi do mitochondrium. Nie mógł on zatem "dowieść istnienia określonej, specyficznej N-sekwencji"! To by było błędne koło, ponieważ program ten bazuje na istnieniu takich sekwencji w znanych białkach!

Program jest oparty na algorytmie, który sprawdza, na ile dana sekwencja różni się od ustalonego wzorca zbudowanego na podstawie kilkuset potencjalnych i rzeczywistych sekwencji sygnalnych.Ten wzorzec, to upraszczając, średnia z tych sekwencji dająca punkt odniesienia. Im bardziej podobna do wzorca, tym wyższe score, czyli prawdopodobieństwo znalezienia się w mit.
>Program ten może nam jedynie pomóc przewidzieć, czy nasze badane białko/białka może mieć lokalizację mitochondrialną.
Aby taką miało, to powinno mieć sek.syg., a tą przecież sprawdza targetP. Do programu dajemy sekwencję białka, a on sprawdza, na ile ta sekwencja jest podobna do wzorca. Program sprawdza sek.syg. dla mit. i dla białek sekrecyjnych np. transportowanych do ER. Wynik dla białka TIM22_YEAST Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM22 OS=Saccharomyces cerevisiae
www.cbs.dt(*)getp,5191EAE804E1A1A5&opt=none
Wynik 0,97 pokazuje b.wysoką korelacje z wzorcem dla sek. mTP, czyli powinno być to białko mit. Doświadczenie pokazuje, że tak jest w rzeczywistości.

>>Wniosek taki jest uprawniony z 90% prawdopodobieństwem, czy jak kto woli skutecznością.
>No nie, bo program nie analizuje wewnętrznych sekwencji kierujących do mitochondrium.

Nie znamy jakiejś specyficznej sekwencji inf., decydującej gdzie ma się znależć białko spośród 4 przedziałów. Sekwencje te są bardzo zróżnicowane i o ile wiem, nie istnieje sekwencja kanoniczna. Poza tym, nie wiemy dlaczego taka, a nie inna sek.wewnętrzna decyduja o takim, a nie innej lokalizacji spośród 4 przedziałow mit.

>>Skąd wiesz, że nie badano w bazie BioGRID 3.2 specyficznych interakcji np. białka Hsp 90 z innymi białkami , niż te, które tam przedstawiono, czyli ok 1000?
>No właśnie nie wiem, bo nie ma tam wpisów o eksperymentalnym stwierdzeniu braku oddziaływania. A brak oddziaływania w określonych warunkach jest jak najbardziej weryfikowalny, chociażby jako brak obecności w immunoprecypitacie pomimo obecności białka w próbce przed immunoprecypitacją oraz obecność we frakcji niezwiązanej. Czasami wynik może być niejednoznaczny - wówczas również nie wiadomo.
>Jeśli nigdzie nie ma informacji o danym oddziaływaniu lub jego braku, to oznacza, że tego nie wiadomo, a nie, że tego oddziaływania nie ma.

Nie wiadomo, czy jest ,a ściślej nie znaleziono (na razie) dowodów eksperymentalnych na istnienie takiej interakcji. Dla drożdży baza jest aktualizowana co miesiąc. Biogrid posiada wiele metod eksperymentalnych potwierdzających istnienie tych interakcji:
wiki.thebiogrid.org/doku.php/experimental_systems

>Brak infomacji w bazie = HSP nie bierze udziału. Tego po prostu dla tych białek nie wiadomo. Jest to weryfikowalne, ale do tej pory nie wiadomo.

No właśnie. Nie wiadomo, czy istnieją interakcje Hsp90 z większością białek mit, ale wiadomo, że istnieją dla ba bardzo małej liczby. Przypominam, że do mit. trzeba przetransportować ok 1000 różnych białek, czyli białkaHsp70/90 powinny wchodzić ze zbliżoną wielkością, a przynajmniej z większością z nich. Analiza tej bazy prowadzi to innego wniosku: ilość białek mit., o których wiadomo, że wchodzą w interakcje z Hsp90 jest śmiesznie mała. W modelach temu białku, jak i Hsp70, przypisuje się rolę transportera do mit. Aby pełniły taką rolę, muszą wchodzić w interakcję, wręcz tworzyć swoisty kompleks transportujący. Dowody są jak na razie znikome, bo wiadomo o znikomej liczbie interakcji z białkami mit. Co ciekawe, Hsp wchodzi w nieporównanie większą liczbę interakcji z białkami jądrowymi, a przecież nie uznaje się, o ile mi wiadomo, że Hsp90 pełni rolę białka transportowego do jądra. Moim zdaniem, uznanie Hsp90/70 jako kluczowego(jedynego?) białka transportujące do mit. jest totalnie nieuprawnioną ekstrapolacją w świetle aktualnej wiedzy.

>W przypadku istnienia specyficznej sekwencji wewnętrznej, to bardziej postulat niż wynik badań eksperymentalnych.

W roku 1996 opublikowano pierwszy przypadek transportu białka to mitochondrium bez udziału charakterystycznej N-końcowej odcinanej sekwencji. Zlokalizowana została określona sekwencja odpowiadająca za kierowanie tego białka do mitochondrium (Internal targeting signal of the BCS1 protein: a novel mechanism of import into mitochondria)

Określone sekwencje wewnętrzne zidentyfikowano również u liaz hemowych (An internal targeting signal directing proteins into the mitochondrial intermembrane space). Kolejny przykład zweryfikowanej eksperymentalnie sekwencji wewnętrznej: Evolutionary aspects of a unique internal mitochondrial targeting signal in nuclear-migrated rps19 of sugar beet (Beta vulgaris L.).

Podobnych publikacji jest nie tak mało. Po prostu nie istnieje jeden mechanizm transportu do mitochondrium.

>Nie opracowano, o ile wiem, jakiegokolwiek programu nawet, o niskiej skuteczności, przewidującego taką sekwencję.

To oznacza tylko tyle, że póki co nie da się bioinformatycznie przewidzieć istnienia wewnętrznych sekwencji kierujących do mitochondrium. Nie koniecznie musi być jedna sekwencja konsensusowa.

Program TargetP przewiduje tylko sekwencje N-końcowe. Wiedząc, że istnieją też wewnętrzne sekwecje kierujące dziwisz się, że TargetP nie identyfikuje sekwencji tranzytowych N-końcowych u części białek mitochondrialnych?

Twoje pytanie z poprzedniego postu:Cytat:
A według Ciebie nie mają "transit peptide" białka, które nie mają kierującej sekwecnji N-końcowej.
"Jak one tam trafiają?" Posiadają nieklasyczną sekwencję wewnętrzną. Przykłady w publikacjach powyżej.

>No właśnie nie wyjaśnia i nie dowodzi:
>- czy i dlaczego Hsp70/90 wiąże się ze wszystkimi białkami mit? Z bazy BioGrid >wynika znikoma ilość białek mit. wchodzących w specyficzne int. z Hsp90.
>- nie dowodzi, że Hsp70/90 pełni rolę białka transportowego, ale tylko, że >zapobiega agregacji i sprzyja prawidłowemu fałdowaniu?

W pewnej pracy pokazano, jak in vitro białka HSP70/HSP90 wiążą rozwinięte białko mitochndrialne, jak zapobiegają zwinięciu tego białka w swojej obecności i "dostarczają" białko do wyizolowanych mitochondriów poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni tych organelli(Binding to Chaperones Allows Import of a Purified Mitochondrial Precursor into Mitochondria).

W świetnej publikacji w Cell, autorzy pokazali mechanizm "dostarczania" białek mitochondrialnych przy pomocy HSP70/HSP80 w komórkach, obejmujący: wiązanie rozwiniętych białek mitochondrialnych przez HSP, kierowanie kompleksu HSP-białko mitochondrialne do zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez specyficzne wiązanie się HSP do określonych receptorów, uwolnienie białka mitochondrialnego z kompleksu, po czym białko to wiąże się z receptorem mitochondrialnym i ulega translokacji (Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70, komentarz w Nature: Molecular chaperones: Plugging the transport gap).

>>Każde białko zaraz po translacji jest rozwinięte i (poza przypadkami białek szybko się zwijających)
>Czyli nie każde, ale część i to też nie zawsze, ale np. w warunkach stresu.

Zdaje się, że nie zrozumiałeś. Każde białko po translacji jest rozwinięte. Prawdopodobnie nie każde potrzebuje chaperonów.

>Baza BioGRID pokazuje dzisiaj, że większość białek mit. nie wchodzi w specyficzne interakcje z Hsp90, to jak to białko może brać udział w ich transporcie?

Co najwyżej takich oddziaływań nie ma tam wpisanych. Poza tym, niekoniecznie HSP musi być uniwersalnym białkiem transportowym.

>No właśnie: z jakim chaperonem mają się wiązać białka mitochondrialne, skoro jest ich tak wiele w cytoplazmie?

Stawiałbym na to, że się z niemal każdym wiążą. Lecz jedynie w kompleksie z HSP mogą trafić w pobliże receptorów mitochondrialnych. Wiązanie z chaperonami jest odwracalne, więc co za różnica.

>Tylko, że może dostarczyć do niego białka niemitochondrialne, do których też się wiąże i to w dużym procencie.

Ale one nie mają sekwencji kierującej, wiążących się z receptorami mitochondrialnymi. Dlatego nie ulegają translokacji do mitochondrium.

>Coś musi rozfałdować to białko mit., bo sek.sygg. jest ukryta.

Są też na ten temat publikacje, ale równie dobrze białko mitochondrialne może pozostać niezwinięte od czasu translacji.

>- czy i dlaczego Hsp70/90 wiąże się ze wszystkimi białkami mit? Z bazy BioGrid wynika znikoma ilość białek mit. wchodzących w specyficzne int. z Hsp90.

To należałoby zweryfikować eksperymetalnie. Np. sprawdzając ile białek ulega transportowi do mitochondrium w obecności inhibitorów aktywności ATPazowej HSP90 i HSP70. Nie wiem, czy jest publikacja o badaniu szerokiego zakresu białek mitochondrialnych.

Tyle na temat mechanizmu trafiania białek do mitochondrium i udziale HSP w tym procesie. W poście poniżej chciałbym się jeszcze odnieść do kwestii niektórych twoich interpretacji i baz danych.

EDIT:
Posty wkleiły się w odwrotnej kolejności, zatem wspomniane kwestie powyżej.

>W roku 1996 opublikowano pierwszy przypadek transportu białka to mitochondrium bez udziału charakterystycznej N-końcowej odcinanej sekwencji. Zlokalizowana została określona sekwencja odpowiadająca za kierowanie tego białka do mitochondrium (Internal targeting signal of the BCS1 protein: a novel mechanism of import into mitochondria)
>Określone sekwencje wewnętrzne zidentyfikowano również u liaz hemowych
>Podobnych publikacji jest nie tak mało.

Nie wiem, ile jest publikacji, ale liczba białek, o których wiadomo, że są transportowane do mit. za pomocą wewnętrznej sek. syg. jest znikomo mała ( kilka?), czyli są to pojedyncze przypadki. Artykuł z Nature z 2010 r www.sfb746(*)2012/Pfanner/schmidt_2010.pdf, czyli kilkanaście lat po odkryciu pierwszej wew. sek. syg. nie przedstawia żadnych nowych sekwencji. Poza tym tym wciąż nie znamy wew. sekwencji kanonicznej, jak to ma miejsce w przypadku N-sekwencji. Trudno dyskutować zatem o mechaniźmie, mając do dyspozycji symboliczną ilość danych. Zgadzam się, że nie istnieje jeden mechanizm transportu do mit. np. transport m-RNA do mit, ale mechanizmie nic mi nie wiadomo. Dyskutujemy zatem tylko o tym, co wiemy, a przynajmniej co naukowcy postulują, jako mechanizm transportu do mit., czyli udział Hsp70/90 i sek. syg.

>To oznacza tylko tyle, że póki co nie da się bioinformatycznie przewidzieć istnienia wewnętrznych sekwencji kierujących do mitochondrium. Nie koniecznie musi być jedna sekwencja konsensusowa.

Nie da się przewidzieć, bo trudno na podstawie kilku przypadków zbudować jakichś sensowny algorytm, gdyż:
Cytat:
www.pnas.org/content/96/21/11752.long
>Program TargetP przewiduje tylko sekwencje N-końcowe. Wiedząc, że istnieją też wewnętrzne sekwecje kierujące

Wiemy, że istnieje tylko kilka udokumentowanych wew.sek.kierujacych i nie dokonywałbym ekstrapolacji o powszechności ich istnienia. Na razie to margines wobec ponad 1000 białek mitochondrialnych.
>dziwisz się, że TargetP nie identyfikuje sekwencji tranzytowych N-końcowych u części białek mitochondrialnych?

Nie dziwię się, że nie identyfikuje, bo ich tam nie ma wg stworzonego algorytmu o wysokiej przewidywalności ich lokalizacji. Mnie zastanawia mechanizm transportu przynajmniej 350 białek nie posiadających N- końcowej sek.syg. Kilka przypadków wew.sek.syg. bynajmniej nie wyjaśnia tego wobec skali problemu i braku sek. kanonicznej. Jeśli są różne, to trzeba najpierw wiele ich zweryfikować i określić precyzyjnie rolę oraz mechanizmy transportu np. jakie receptory, białka transportujące, sposób integracji procesu. Przy kilku przypadkach nie stworzy się sensownego modelu, a tym bardziej nie można dokonywać na tej podstawie ekstrapolacji.
>Twoje pytanie z poprzedniego postu: Wniosek: są białka, które nie mają transit peptide, a mimo to znajdują się w mitochondrium.

>"Jak one tam trafiają?" Posiadają nieklasyczną sekwencję wewnętrzną.

Wiemy, że istnieje kilka o niskiej homologi wew.sek.syg., ale to nie jest wyjaśnienie mechanizmu transportu przynajmniej 350 białek, o których nie wiemy, czy posiadają wew. sek. syg. Może być tak, że posiadają wiele różnych sek. syg. ( N-końcowych i wew.), ale to tylko komplikuje sprawę, a nie ją wyjaśnia.

>W pewnej pracy pokazano, jak in vitro białka HSP70/HSP90 wiążą rozwinięte białko mitochndrialne, jak zapobiegają zwinięciu tego białka w swojej obecności i "dostarczają" białko do wyizolowanych mitochondriów poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni tych organelli(Binding to Chaperones Allows Import of a Purified Mitochondrial Precursor into Mitochondria).

Badania in vitro są dla mnie mało przekonywujące. To, że in vitro jakieś białko trafia do mit., nie musi oznaczać, że tak jest in vivo. Na podstawie 1 przypadku w sztucznych warunkach nie ma co budować modelu. Prawdę mówiąc, nie wiem, co za białko brało udział w tym eksperymencie, ale chyba to nie było typowe białko mit. Doświadczenie in vitro nie uwzględnia molecular crowding, czyli olbrzymiej liczby potencjalnych niespecyficznych, często szkodliwych interakcji oraz zagęszczenia makromolekuł. Ciekawsze by było, gdyby przebadano in vitro dużą liczbę różnych białek mit, również tych bez sek.syg. oraz dla porównania białka, które nie rezydują w mit., ale o których wiadomo, że wchodzą w interakcję w Hsp90. Zresztą w tej pracy napisano:
Cytat:

>W świetnej publikacji w Cell, autorzy pokazali mechanizm "dostarczania" białek mitochondrialnych przy pomocy HSP70/HSP80 w komórkach, obejmujący: wiązanie rozwiniętych białek mitochondrialnych przez HSP, kierowanie kompleksu HSP-białko mitochondrialne do zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez specyficzne wiązanie się HSP do określonych receptorów, uwolnienie białka mitochondrialnego z kompleksu, po czym białko to wiąże się z receptorem mitochondrialnym i ulega translokacji

To, że pokazali mechanizm, to nie znaczy, że wyjaśnili problemy, które tu przedstawiłem. Artykuł www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12526792 pokazuje, że hsp70/90 mają receptor w błonie mit. Tom70. BioGrid to potwierdza. To jednak nie dowodzi, że Hsp70/90 są transporterami białek do mit, a tylko tego mają tam receptor. Zresztą Tom70 wchodzi w interakcje z wieloma białkami i Hsp70/90 nie jest wyjątkiem ( u drożdży wiadomo, że aż u 160 białek!)
thebiogrid.org/35706
Czy tamte też biorą udział w transporcie, a jeśli tak, to proszę o dowody i wyjaśnienie mechanizmu transportu?
Jeśli Hsp70/90 się wiąże z receptorem, to czy tak samo skutecznie się wiąże połączony z białkiem mitochondrialnymi? To przecież jest już inny kompleks, choćby pod względem przestrzennym. Z iloma się tak wiąże Hsp70/90, bo baza Biogrid nie daje im zbyt wiele białek mit? Model to nie rzeczywistość, in vitro to nie in vivo, opis to nie wyjaśnienie. Białko Hsp70/90 nie jest receptorem, nie wiąże się specyficznie do określonego białka, ale ma dużo potencjalnych białek, z którymi może wchodzić lub wchodzi w interakcję ,a mimo to nie są one transportowane do mit. Tego ten model nie wyjaśnia, jak i nie wyjaśnia transportu białek bez N-sek. syg., bo udowodniona ilość wew.sek.syg. jest zaniedbywalnie mała, aby uogólniać i tworzyć spójny mechanizm.

>Co najwyżej takich oddziaływań nie ma tam wpisanych. Poza tym, niekoniecznie HSP musi być uniwersalnym białkiem transportowym.

Na razie nie udowodniono, że Hsp jest białkiem transportującym, ale, że posiada receptor w mit. Z tego, co przeczytałem tutaj , to jedynie ma udowodnioną, u drożdży rolę jako chaperon:
Cytat:

Jeśli Hsp70/90 nie jest jedynym, to jakie są inne, jakie mają receptory i jaki jest mechanizm transportu, nie hipotetyczny, ale udowodniony?

>Stawiałbym na to, że się z niemal każdym wiążą.
To tylko Twoje przypuszczenie, czy posiadasz jakieś dowody naukowe?

>Lecz jedynie w kompleksie z HSP mogą trafić w pobliże receptorów mitochondrialnych.

Tylko jeśli Hsp wiąże się z niemal każdym białkiem, a z tego co wiemy, to rzeczywiście z wieloma( ponad 1000) to pojawia się problem selekcji tego " właściwego" czyli, aby tylko mitochondrialne zostały przetransportowane do błony mit za pomocą kompleksu Tom70 lub innego. Kompleks Hsp-białko "sprawdza" każde, czy pasuje do receptora i pozwala się związać tylko mit.? To by było czasochłonne. Poza tym, skąd taki kompleks wie, gdzie ma się przemieszczać, czyli co go o tym informuje? Swoją drogą: istnieje receptor dla Hsp70/90, ale czy udowodniono istnienie receptora dla białek mitochondrialnych. To, że posiadają N- sek.syg. nie oznacza, że istnieje receptor dla nich, tym bardziej, że wchodzą do mit. białka jego pozbawione
>Wiązanie z chaperonami jest odwracalne, więc co za różnica.

Jak dokonać selekcji tego właściwego, skoro w cytoplazmie jest miliony białek różnych rodzajów?

>Ale one nie mają sekwencji kierującej, wiążących się z receptorami mitochondrialnymi. Dlatego nie ulegają translokacji do mitochondrium.

Tylko, że receptor jest dla Hsp70/90, a czy dla każdego białka mit.? Nie mają N-sek.syg. a jednak wchodzą do mit, a inne sek. to na razie pojedyńcze przypadki. Zresztą to oznacza, ze sek.syg. jest mocno zdegenerowana, i potencjalnie wiele białek, nawet tych niemitochondrialnych mogłoby wejść, a jednak nie ma to miejsca.

>Są też na ten temat publikacje, ale równie dobrze białko mitochondrialne może pozostać niezwinięte od czasu translacji.

Czy są jakieś dowody i jak wielu białek one dotyczą? Białko Hsp 70/90 pomaga się zwijać, więc jak białko mit. może po translacji być niezwiniete?

>To należałoby zweryfikować eksperymetalnie. Np. sprawdzając ile białek ulega transportowi do mitochondrium w obecności inhibitorów aktywności ATPazowej HSP90 i HSP70. Nie wiem, czy jest publikacja o badaniu szerokiego zakresu białek mitochondrialnych.

Szkoda, że tego nie wiemy?

>W świetnej publikacji w Cell, autorzy pokazali mechanizm "dostarczania" białek mitochondrialnych przy pomocy HSP70/HSP80 w komórkach, obejmujący: wiązanie rozwiniętych białek mitochondrialnych przez HSP, kierowanie kompleksu HSP-białko mitochondrialne do zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez specyficzne wiązanie się HSP do określonych receptorów, uwolnienie białka mitochondrialnego z kompleksu, po czym białko to wiąże się z receptorem mitochondrialnym i ulega translokacji

To, że pokazali mechanizm, to nie znaczy, że wyjaśnili problemy, które tu przedstawiłem. Artykuł www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12526792 pokazuje, że hsp70/90 mają receptor w błonie mit. Tom70. BioGrid to potwierdza. To jednak nie dowodzi, że Hsp70/90 są transporterami białek do mit, a tylko tego mają tam receptor. Zresztą Tom70 wchodzi w interakcje z wieloma białkami i Hsp70/90 nie jest wyjątkiem ( u drożdży wiadomo, że aż u 160 białek!)
thebiogrid.org/35706
Czy tamte też biorą udział w transporcie, a jeśli tak, to proszę o dowody i wyjaśnienie mechanizmu transportu?
Jeśli Hsp70/90 się wiąże z receptorem, to czy tak samo skutecznie się wiąże połączony z białkiem mitochondrialnymi? To przecież jest już inny kompleks, choćby pod względem przestrzennym. Z iloma się tak wiąże Hsp70/90, bo baza Biogrid nie daje im zbyt wiele białek mit? Model to nie rzeczywistość, in vitro to nie in vivo, opis to nie wyjaśnienie. Białko Hsp70/90 nie jest receptorem, nie wiąże się specyficznie do określonego białka, ale ma dużo potencjalnych białek, z którymi może wchodzić lub wchodzi w interakcję ,a mimo to nie są one transportowane do mit. Tego ten model nie wyjaśnia, jak i nie wyjaśnia transportu białek bez N-sek. syg., bo udowodniona ilość wew.sek.syg. jest zaniedbywalnie mała, aby uogólniać i tworzyć spójny mechanizm.

>Co najwyżej takich oddziaływań nie ma tam wpisanych. Poza tym, niekoniecznie HSP musi być uniwersalnym białkiem transportowym.

Na razie nie udowodniono, że Hsp jest białkiem transportującym, ale, że posiada receptor w mit. Z tego, co przeczytałem tutaj , to jedynie ma udowodnioną, u drożdży rolę jako chaperon:
Cytat:

Jeśli Hsp70/90 nie jest jedynym, to jakie są inne, jakie mają receptory i jaki jest mechanizm transportu, nie hipotetyczny, ale udowodniony?

>Stawiałbym na to, że się z niemal każdym wiążą.
To tylko Twoje przypuszczenie, czy posiadasz jakieś dowody naukowe?

>Lecz jedynie w kompleksie z HSP mogą trafić w pobliże receptorów mitochondrialnych.

Tylko jeśli Hsp wiąże się z niemal każdym białkiem, a z tego co wiemy, to rzeczywiście z wieloma( ponad 1000) to pojawia się problem selekcji tego " właściwego" czyli, aby tylko mitochondrialne zostały przetransportowane do błony mit za pomocą kompleksu Tom70 lub innego. Kompleks Hsp-białko "sprawdza" każde, czy pasuje do receptora i pozwala się związać tylko mit.? To by było czasochłonne. Poza tym, skąd taki kompleks wie, gdzie ma się przemieszczać, czyli co go o tym informuje? Swoją drogą: istnieje receptor dla Hsp70/90, ale czy udowodniono istnienie receptora dla białek mitochondrialnych. To, że posiadają N- sek.syg. nie oznacza, że istnieje receptor dla nich, tym bardziej, że wchodzą do mit. białka jego pozbawione
>Wiązanie z chaperonami jest odwracalne, więc co za różnica.

Jak dokonać selekcji tego właściwego, skoro w cytoplazmie jest miliony białek różnych rodzajów?

>Ale one nie mają sekwencji kierującej, wiążących się z receptorami mitochondrialnymi. Dlatego nie ulegają translokacji do mitochondrium.

Tylko, że receptor jest dla Hsp70/90, a czy dla każdego białka mit.? Nie mają N-sek.syg. a jednak wchodzą do mit, a inne sek. to na razie pojedyńcze przypadki. Zresztą to oznacza, ze sek.syg. jest mocno zdegenerowana, i potencjalnie wiele białek, nawet tych niemitochondrialnych mogłoby wejść, a jednak nie ma to miejsca.

>Są też na ten temat publikacje, ale równie dobrze białko mitochondrialne może pozostać niezwinięte od czasu translacji.

Czy są jakieś dowody i jak wielu białek one dotyczą? Białko Hsp 70/90 pomaga się zwijać, więc jak białko mit. może po translacji być niezwiniete?

>To należałoby zweryfikować eksperymetalnie. Np. sprawdzając ile białek ulega transportowi do mitochondrium w obecności inhibitorów aktywności ATPazowej HSP90 i HSP70. Nie wiem, czy jest publikacja o badaniu szerokiego zakresu białek mitochondrialnych.

Szkoda, że tego nie wiemy?

>Dzisiaj już nie ma wątpliwości, że wiele białek mitochondrialnych nie ma "transit peptide" , a czy to będzie 50% czy 30% to już jest kwestia drugorzędna, bo to i tak jest kilkaset makrocząsteczek.
Teraz może walnę gafę, ale czy transit peptide nie jest przypadkiem białkiem tranzytowym?
sekwencja sygnałowa to coś innego - signalling sequence na przykład, ale można spotkać też nazwę "domain" lub pewnie inne.
Nie bardzo przemawia do mnie tłumaczenie peptide jako sekwencja, bowiem oznacza to całe białko.

>Teraz może walnę gafę, ale czy transit peptide nie jest przypadkiem białkiem tranzytowym?

Nie. To synonim sekwencji sygnałowej w tym przypadku. Choć też uważam, że jest to mylące i termin "sekwencja sygnałowa/sygnalna" jest o wiele precyzyjniejszy.

>>Teraz może walnę gafę, ale czy transit peptide nie jest przypadkiem białkiem tranzytowym?
>Nie. To synonim sekwencji sygnałowej w tym przypadku. Choć też uważam, że jest to mylące i termin "sekwencja sygnałowa/sygnalna" jest o wiele precyzyjniejszy.
Dodajmy - wyłącznie sekwencji sygnałowej na N końcu, nie dotyczy to wewnętrznych sekwencji sygnałowych.

> Spośród 747 białek mit.drożdż niecałe 50% zawiera sekwencję kierującą ( transit peptide).
>www.unipro(*)my:559292 keyword:496#9994
>Co ciekawe, i sprzeczne z tym, co wielu uważa, białka nie posiadające sekwencji kierującej trafiają jednak do mitochondrium, a potem do ich specyficznych przedziałów. Spośród 69 białek błony zewnętrznej, tylko jedno miało sekwencję kierującą. Jak zatem one trafiają do mito?
Ok - wyniuchałam kwestię nazwy transit peptide - dotyczy to wyłącznie sekwencji na N końcu, a Wojtaszek twierdzi, że występują dodatkowo sekwencje wewnętrzne.
Nie - nie mam danych źródłowych, ufam porządnemu podręcznikowi.