We tried as hard as we could to replicate the original published results using the methods described and were unable to detect these cells in either the bone marrow or the blood of laboratory mice.

But the network [prof. Ratajczaka] became rattled after one collaborator, Józef Dulak at the Jagiellonian University in Krakow, failed to find traces of VSELs in his experiments. When he published his findings in May, Ratajczak tried to force him out of the consortium.

It would be also interesting if others would carefully analyze the content of numerous papers published on VSELs by Dr. Ratajczak's group since 2006. It seems that some figures, photographs, tables and texts on VSELs look very similar in different articles without relevant references to previous publications.
Jozef Dulak & Alicja Jozkowicz

... we maintain the conclusion that the hypothesis implying pluripotent features of VSELs in adult bone marrow has not been independently confirmed.

Prof. Mariusz Ratajczak, jako pierwszy Polak w historii, otrzymał prestiżową Nagrodę im. Karla Landsteinera przyznawaną co 2 lata przez the German Society for Transfusion Medicine and Immunohematology za wybitne osiągnięcia w dziedzinie transfuzjologii i hematologii. Prof. Ratajczak został wyróżniony za badania nad mobilizacją komórek macierzystych układu krwiotwórczego oraz za odkrycie komórek o cechach embrionalnych komórek macierzystych (ang. very small embryonic-like stem cell, VSEL)[12].

Komórki VSEL

W 2006 roku zespół prof. Ratajczaka ogłosił odkrycie w szpiku kostnym myszy[14], a rok później we krwi pępowinowej człowieka[15] komórek o cechach embrionalnych komórek macierzystych (ang. very small embryonic-like stem cell, VSEL). Kolejne badania wykazały również obecność komórek VSEL w płucach, nerkach, mózgu, trzustce i mięśniach dorosłej myszy[16]. Komórki takie wyizolowano pokazując ich morfologię oraz ekspresję genów typową dla wczesnych komórek epiblastu i migrujących wczesnych komórek zarodkowych.

Obecność w tkankach dorosłych myszy i człowieka materiału biologicznego o morfologii opisanej w pracach zespołu prof. Ratajczaka w chwili obecnej została potwierdzona przez szereg innych niezależnych zespołów[17][18][19][20][21][22], jednak kwestia wykazywania przez VSEL postulowanej pluripotencji, będącej cechą komórek macierzystych, jest ciągle sprawą dyskusyjną i specjaliści nie są tu zgodni[23].

Krytycy podkreślają, że część zespołów koncentrowała się wyłącznie na rozmiarze VSEL i immunofenotypie, bez rzeczywistego zbadania ich zdolności do różnicowania się (ściślej: pluripotencji), która ma je upodabniać do komórek macierzystych[24][23]. Osiem badań potwierdza różnicowanie się VSEL[25][26][27][18][28][29][30][31]. Z drugiej jednak strony cztery zespoły nie stwierdziły pluripotencji VSEL[32][33][34][34][23]. Najnowsza praca opublikowana na łamach czasopisma Thrombosis and Haemostasis wskazuje jednak na istnienie komórek VSEL, a także, co bardzo istotne z punktu widzenia debaty naukowej, potwierdza ich potencjał angiogenny[29]. Kolejnym argumentem "za" jest praca zespołu Chen i wsp., który zidentyfikował obecność VSEL w wątrobie, jak również dowiódł istnienia potencjału regeneracyjnego komórek[30]. Ponadto Lee i wsp. potwierdzili obecność komórek o fentoypie bardzo zbliżonym do VSEL w naczyniach limfatycznych i krwionośnych. Opisane przez autorów komórki NDSC (ang. node and duct stem cells) wykazują zdolność do różniocowania się w komórki neuronalne in vitro. W modelu in vivo uszkodzenia niedokrwiennego mózgu NDSC wykazały korzystne działanie naprawcze, co przemawia za ich potencjałem proliferacyjnym[31].

W 2013 roku prof. Józef Dulak z Uniwersytetu Jagiellońskiego, partner w konsorcjum Innowacyjne metody wykorzystania komórek macierzystych w medycynie, koordynowanym przez prof. Ratajczaka, opublikował pracę, w której także twierdził, że VSEL nie wykazują cech komórek macierzystych i w znacznej części są komórkami obumierającymi lub martwymi, a prof. Ratajczak używał niewłaściwych primerów Oct4, dających fałszywie pozytywne wyniki. Zdaniem krytyków wyjaśnia to obserwacje markerów pluripotencji przy rzeczywistym braku tej cechy w badanym materiale[34]. W pracy opublikowanej na łamach Stem Cell and Development prof. Ratajczak prezentuje szczegółowy opis protokołu izolacji VSEL oraz wskazuje potencjalne trudności, z jakimi może spotkać się badacz chcący wyizolować komórki[35].

Kontrargumentem w debacie naukowej może być fakt odkrycia różnych izoform genu Oct4 u myszy (Oct4A, Oct4B)[36] 2 lata po opublikowaniu pierwszego doniesienia o VSEL[14], co tłumaczy brak uwzględnienia tego faktu w przeprowadzonym badaniu. Ponadto zespół prof. Ratajczaka w swoich pracach zaznaczał, że ze względu na istnienie szeregu pseudogenów Oct4 oraz niespecyficzne barwienia immunohistochemiczne istnieje konieczność epigenetycznej oceny stanu metylacji sekwencji promotora Oct4. W 2008 grupa ta opublikowała dane[37] pokazujące, iż w komórkach VSEL izolowanych z mysiego szpiku kostnego, podobnie jak w mysich komórkach embrionalnych, sekwencja ta nie ulega metylacji, co skutkuje ekspresją mRNA Oct4, a dodatkowo promotor genu Oct4 związany jest ze wzorem białek histonowych typowych dla aktywnie transkrypcyjnej chromatyny. Pokazano również, podobnie jak w pracach z 2006 jądrową lokalizację białka Oct4[14][37] typową dla izoformy Oct4A. Argumentów "za" dostarczają doniesienia innych zespołów, które także wykazały ekspresję genu Oct4A w populacji VSEL[17][18]. W 2011 grupa prof. Ratajczaka opublikowała dane dotyczące globalnej ekspresji genów w komórkach VSEL[38] przy wykorzystaniu platformy GeneChipR 3' Mouse Genome 430 2.0 array (Affymetrix). Wykazano, iż za utrzymanie charakteru pluripotencjalnego tych komórek odpowiedzialne są trzy geny Oct4, Nanog oraz Sox2 przy udziale białek Polycomb[38].

Przeciwnicy hipotezy zarzucają również, iż komórki VSEL nie spełniają kryterium samo-odnowy oraz proliferacji, które stawiane są komórkom macierzystym. Odpowiedzią prezentowaną przez zespół prof. Ratajczaka jest mechanizm molekularny polegający na modyfikacji epigenetycznej genów. Według autorów polega on na charakterystycznym naznaczeniu genomowym, co implikuje stan spoczynkowy VSEL w dorosłych tkankach[37].

Kolejnym argumentem podnoszonym przez zwolenników hipotezy jest fakt, że pod względem molekularnym komórki VSEL przypominają najwcześniejsze rozwojowo migrujące pierwotne komórki płciowe, u których również wykazano epigenetyczne zmiany genów podlegających piętnowaniu genomowemu. W tym kontekście badacze prezentują wyniki przemawiające za tym, iż komórki te również nie proliferują in vitro, ich jądra komórkowe nie mogą być wykorzystane do utworzenia klonoty oraz nie mają zdolności komplementowania rozwoju blastocysty[39]. W pracy pokazano również, że pierwotne komórki płciowe po przywróceniu somatycznego wzoru piętna genomowego przypominają komórki embrionalne tzn. proliferują in vitro, różnicują się we wszystkie listki zarodkowe, komplementują rozwój blastocysty. Kluczowym, z punktu widzenia debaty naukowej, wydaje się potwierdzenie lub zaprzeczenie możliwości odwrócenia zmian epigenetycznych dotyczących genów wykazujących piętno genomowe w komórkach VSEL - podobnie, jak dla pierwotnych komórkach płciowych.

Zdaniem zwolenników VSEL rozbieżności w uzyskanych danych, w kontekście przedstawionych powyżej argumentów, wynikają najprawdopodobniej z zastosowania odmiennych protokołów badawczych w stosunku do metodyki opisanej przez zespół prof. Ratajczaka[40]. Zdaniem krytyków, to na odkrywcy spoczywa ciężar dowodu i opisania swojej procedury w taki sposób, aby badania dawało się powtórzyć[23]. Prof. Ratajczak przedstawia dokładną metodologię izolacji VSEL w najnowszej publikacji[35].

Publikacja, która ukazała się na łamach Nature Cell Biology[41] rzuca nowe światło na rolę Oct4. Autorzy pracy stwierdzają, iż Oct4A nie jest konieczny do uzyskania przez komórkę stanu totipotencji oraz indukcji pluripotencji. W przypadku utrzymania się tej hipotezy spór naukowy o Oct4 w stosunku do VSEL, jak i innych komórek macierzystych, których potencjał różnicowania określano za pomocą oceny ekspresji genu Oct4 przestałby mieć znaczenie. Geny Nanog i Sox2, które ulegają ekspresji w VSEL nadal pozostałyby markerami pluripotencji.

Istnieją także przesłanki teoretyczne pluripotencji VSEL. Koncepcja obecności wczesnych rozwojowo komórek macierzystych w dorosłych tkankach w sposób alternatywny tłumaczy postulowane zjawisko tzw. plastyczności komórek macierzystych, oznaczające iż przykładowo komórki macierzyste układu krwiotwórczego mogą różnicować się w komórki macierzyste mięśnia sercowego lub układu nerwowego. Zgodnie z hipotezą zespołu prof. Ratajczaka jest to wynik różnicowania się komórek VSEL występujących m.in. w szpiku kostnym lub krwi pępowinowej[40]. Komórki VSEL mają więc dawać początek innym wczesnym rozwojowo komórkom opisanym w przeciągu ostatnich lat w tkankach dorosłych myszy i człowieka, którym mogą odpowiadać takie komórki jak np. komórki MASC[42], MIAMI[43], USSC[44], Muse Cells[45][46], MAPC[47] czy Omnicyty[48]. Można na tej podstawie przyjąć, że byłyby najwcześniejszymi rozwojowo komórkami występującymi w dorosłych tkankach.

Komórki VSEL mają w odpowiednich modelach doświadczalnych różnicować się w komórki układu krwiotwórczego[49][50][51], tkanki kostnej[26], śródbłonka naczyniowego, kardiomiocyty[27], komórki nabłonka płuc[25] oraz komórki gamet żeńskich i męskich[17][18][21][52], co potwierdzałoby ich pluripotencję. Jednocześnie jednak nie tworzą potworniaków[37], co z jednej strony może być zaletą w zastosowaniach medycznych, z drugiej strony jest argumentem przeciwko ich pluripotencji[40][53]. Definicja "pluripotencji" pochodzi z badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC). Przy charakterystyce tych komórek badacze określili kryteria in vivo i in vitro. Do kryteriów in vivo należy m.in. tworzenie potworniaków. VSEL są "embyonic-like", ale nie spełniają sensu stricto definicji komórek pluripotentnych w rozumieniu kryteriów dla ESC - nie tworzą potworniaków.

Komórki VSEL zdaniem odkrywców znajdują się w dorosłych tkankach w stanie uśpienia, a ich stan spoczynkowy jest regulowany zmianami epigenetycznymi niektórych genów biorących udział w sygnałowaniu czynników insulinowych[54]. Liczba tych komórek w dorosłych tkankach, jak wykazują badania na dlugo i krótko żyjących myszach, koreluje z okresem przeżycia[55][56][57] i może mieć związek z powstawaniem niektórych nowotworów[58][59].

Potencjał kliniczny komórek VSEL w kontekście medycyny regeneracyjnej (możliwość różnicowania w różne typy komórek dorosłego organizmu, a także, w odróżnieniu od ESC[60] lub iPSC[61], brak właściwości onkogennych[37]) zachęca do prób aplikacji tej technologii u ludzi. Komórkami tymi interesuje się obecnie szereg firm biotechnologicznych (np. Neostem Inc., Pharmacells Inc.) Podjęto pierwsze próby kliniczne ich wykorzystania sponsorowane przez Narodowy Instytut Zdrowia w USA oraz Departament Obrony USA w leczeniu schorzeń kości[62], ran skóry[63] i uszkodzeń siatkówki (m.in. zwyrodnienie plamki żółtej oraz retinopatia barwnikowa)[64]. Projekty realizowane są na Uniwersytecie Michigan, Ann Arbor, Boston University oraz w Harvard Medical School.

Możliwość pozyskania komórek o cechach zbliżonych do ESC od dorosłego człowieka bez konieczności niszczenia embrionów ludzkich rozwiązuje istotną kwestię etyczną związaną z embrionalnymi komórkami macierzystymi. Profil komórek VSEL wpisuje się ponadto w doktrynę Kościoła katolickiego, który zainwestował w badania VSEL przez firmę NeoStem. W ostatniej pracy prof. Ratajczak dyskutuje ten problem[40].