Dlaczego badania wykorzystujące skanowanie całego genomu zawodzą?

Różnice te mają ważkie implikacje dla wysiłków zmierzających do poznania genów odpowiedzialnych za podatność na choroby. W wyniku owej zmienności międzypopulacyjnej nie możemy zakładać, że markery skojarzone z chorobą w jednej populacji wykażą takie same asocjacje w innych grupach (jest to oczywiście tym bardziej prawdziwe dla rzadkich wariantów). Obecne badania GWAS zostały zdominowane przez uczestników o zachodnioeuropejskich korzeniach. Nasze zrozumienie genetycznych wariantów ryzyka w populacjach pozaeuropejskich jest praktycznie zerowe. Dodatkowo, różnice międzypopulacyjne oznaczają, że mieszanie ludzi o różnym pochodzeniu w jednej kohorcie osobników dotkniętych chorobą może poważnie zaburzyć identyfikację genów kauzalnych – w pewnych okolicznościach takie mieszanie może znacząco zwiększyć ryzyko uzyskania wyników fałszywie pozytywnych.

Rozwiązanie: Aby wyniki GWAS mogły mieć uniwersalne zastosowanie będą musiały być wykonywane na kohortach pochodzących z szerokiego wachlarza populacji. Zestawy danych w rodzaju HapMap Project, Human Genome Diversity Panel i nowy, potężny 1000 Genomes Project dostarczą informacji na temat wzorów wariacji genetycznej w zróżnicowanych populacjach, co konieczne jest dla skonstruowania odpowiednich planów badawczych GWAS. Poważniejsze wyzwanie wiąże się z gromadzeniem dużych próbek o względnie jednorodnej przeszłości genetycznej – dotyczy to zarówno chorych, jak i grupy kontrolnej. Problem jest zwłaszcza dotkliwy dla populacji afrykańskich, w których nierównowaga sprzężeń jest niższa a zróżnicowanie genetyczne znacznie większe w porównaniu z innymi grupami (oznacza to, że znacznie większa liczba markerów i próbek DNA jest konieczna, aby zidentyfikować wariant niosący ryzyko). Poza tym, w Afryce, podobnie zresztą jak w większości krajów naszego świata, lokalne rządy mają z reguły bardziej palące problemy w zakresie opieki zdrowotnej, aniżeli przeprowadzanie badań GWAS.

Epistaza – interakcje miedzy genami

Problem: większość aktualnych podejść do badań genetycznych zakłada, że ryzyko związane z genami jest addytywne, czyli, inaczej mówiąc, że obecność dwóch czynników ryzyka (wariantów) u jednego badanego zwiększy jego ogólne ryzyko o sumę obu tych czynników. Nie ma jednak powodów, żeby przypuszczać, że zawsze tak się dzieje. W wyniku interakcji epistatycznych podatność na chorobę związana z posiadaniem dwóch genów ryzyka jest większa (lub mniejsza) aniżeli suma każdego z ryzyk wziętych z osobna. Interakcje epistatyczne są bardzo trudne do zidentyfikowania w badaniach typu GWAS. W sytuacji kiedy epistaza jest silna, kilka zaledwie genów – każdy niosący niewielkie, nieprzekraczające progu statystycznego, ryzyko – może wspólnie wyjaśniać sporą część zmienności. Takie przypadki pozostają właściwie niewidzialne dla aktualnych strategii.

Rozwiązanie: Duży rozmiar próbki oraz sprytne techniki analityczne. Tutaj nie będę się rozpisywał, ponieważ zagadnienia epistazy leżą poza obszarem mojej kompetencji. Szczęśliwie, są one przedmiotem intensywnej aktywności badawczej (patrz, na przykład, Epistasis Blog). Z chęcią usłyszałbym komentarze ludzi, którzy wiedzą więcej nt. epistazy – związanych z nią problemów i dostępnych metod zaradczych.

CNV ^{[ 7 ]}

Problem: Jedną z większych niespodzianek ostatnich pięciu lat było odkrycie szeroko rozpowszechnionych w genomie, dużych insercji i delecji DNA, zwanych copy number variations (CNV). Uważa się, że CNV składają się na istotną część ludzkiej zmienności genetycznej. Wykazano, że odgrywają one rolę w wariacji ekspresji genów oraz ewolucji. Łatwo wyobrazić sobie, że CNV są odpowiedzialne za niebanalną część podatności na choroby powszechne.

Nasze pojęcie na temat tego rodzaju wariacji genetycznej jest wciąż w powijakach. Chipy obecnie używane w GWAS badają zmienność pojedynczych par zasad genomu (SNPy) i pozwalają jedynie na pośrednią detekcję niewielkiej ilości CNV. Dzieje się to przez analizę zniekształceń intensywności sygnału, wzorców dziedziczenia lub dzięki SNPom „tagującym” ^{[ 8 ]} (SNPy znajdujące się bardzo blisko CNV i za sprawą tego wspólnie dziedziczone). Tym niemniej, przeważająca większość CNV pozostaje nieuchwytna dla współczesnych technologii GWAS.

Rozwiązanie: Chipy o wysokiej rozdzielczości – obejmujące miliony wariantów – mogą być użyte do eksploracji CNV w niektórych regionach genomu, nie sprawdzają się jednak w przypadku dużych odcinków genomu zawierających powtarzalne elementy. Ostatecznie, pełne rozpoznanie CNV u chorych i grup kontrolnych będzie wymagało całogenomowego sekwencjonowania, i to najlepiej z użyciem metod o większym zasięgu niż ten umożliwiony przez rozwijające się ostatnio techniki szybkiego sekwencjonowania.

Dziedziczenie epigenetyczne

Problem: Nie wszystkie informacje dziedziczne zawierają się w genomowej sekwencji DNA. Obok niej, potomek otrzymuje również od rodziców tzw. informację epigenetyczną, która w postaci chemicznych modyfikacji DNA, ale bez zmiany samej sekwencji, wpływa na ekspresję genów, a w efekcie i ekspresję cech fenotypowych. Chociaż nie ma wątpliwości w kwestii występowania dziedziczenia epigenetycznego, to poziom, do jakiego odbija się ono na zmienności fenotypowej i podatności na choroby pozostaje w zasadzie zupełnie nieznany.

Wszystkie istniejące technologie używane w GWAS opierają się na sekwencji DN i nie mają w związku z tym możliwości detekcji wariacji epigenetycznej. Zmiany epigenetyczne pozostają niewidoczne nawet dla całogenomowego sekwencjonowania.

Rozwiązanie: W pierwszej kolejności musi zostać rozstrzygnięte, czy wariacje dziedziczone epigenetycznie rzeczywiście przyczyniają się w stopniu większym niż pomijalny do zmienności ryzyka chorób. Jeśli tak jest, to rozwijane obecnie, wysoce wydajne metody identyfikacji wariacji epigenetycznej zostaną zaprzęgnięte do badań EWAS (epigenome-wide association studies).

Niejednorodność (heterogeniczność) choroby

Problem: Pewne „choroby” są w istocie zbiorem symptomów, które wynikać mogą z wielorakich i odrębnych przyczyn genetycznych. Włączanie pacjentów o różnych przypadłościach do tej samej kohorty w badaniu GWAS to niezawodny przepis na niepowodzenie. Nawet jeśli istnieją wyraźne genetyczne czynniki ryzyka dla każdej z tych przypadłości, możemy się spodziewać, że zostaną one zagubione w hałasie pochodzącym od pozostałych, niezwiązanych symptomów. Zasadniczy problem dotyczy tego, że dla niektórych chorób – zwłaszcza schorzeń psychiatrycznych, gdzie przyczyny kryją się głęboko w otchłani skomplikowanego i słabo poznanego organu, jakim jest ludzki mózg – wiedza i narzędzia niezbędne do podzielenia pacjentów w homogeniczne podkategorie są wciąż słabo zaawansowane.

Rozwiązanie: Rozwiązanie tego problemu nie leży w kompetencjach genetyków. Tylko wspólny wysiłek pracowników klinicznych, psychologów i badaczy medycznych pozwoli rozczłonkować złożone syndromy chorobowe na diagnostycznie użyteczne subkategorie, z których każda będzie mogła zostać poddana oddzielnej analizie genetycznej. Na polu badań nad nowotworami objawy grupowane uprzednio, jako osobna jednostka chorobowa zostały obecnie odseparowane od siebie, dzięki użyciu nowych technologii, takich jak mikromacierze ekspresji genetycznej. Podobna strategia z pewnością przyniesie rezultaty w szeregu innych chorób, chociaż niedostępność ludzkiej tkanki mózgowej utrudni jej stosowanie w przypadku chorób psychiatrycznych.

Przyszłość badań genetycznych

Chociaż opierające się na chipach technologie GWAS osiągnęły pewne sukcesy w zrywaniu najniżej wiszących owoców z genetycznego drzewka powszechnych chorób, to wygląda na to, że dopiero co zaczynają stawiać odpór przeszkodom niemożliwym do pokonania przez samo zwiększanie rozmiarów próbki. W istocie, obecne technologie powinny być uważane za okres przejściowy prowadzący do całogenomowego sekwencjonowania, które ma szanse stać się dostępnym dla wielkich projektów badawczych w ciągu najbliższych 3-5 lat.

Istnieje spore prawdopodobieństwo, że zastosowanie tanich metod szybkiego sekwencjonowania wygeneruje ilości nieznanych dotychczas genów ryzyka, które dalece przekroczą obecne żniwo GWAS. Będzie to możliwe dzięki równoczesnemu dostępowi do rzadkich wariantów oraz CNV, które są aktualnie poza zasięgiem GWAS. Jednakowoż, zbudowanie bardziej kompletnego katalogu dziedzicznych wariantów przenoszących ryzyko chorób powszechnych będzie wymagało więcej aniżeli tanie sekwencjonowanie: konieczny będzie rozwój technik diagnostycznych w kierunku bardziej homogenicznej kategoryzacji pacjentów oraz stworzenie nowych i potężnych podejść analitycznych pozwalających na radzenie sobie z nawałnicą danych pochodzących z sekwencjonowania i identyfikację interakcji epistatycznych miedzy genami. Aby posiadać jakąkolwiek szansę na wykrycie wariantów o niewielkim wpływie na ryzyko wśród tej ilości danych potrzebne będą niesłychanie wielkie grupy uczestników. Tworzone obecnie gigantyczne kohorty, takie jak 500 tysięczna UK Biobank, czy kohorta tworzona z pieniędzy National Institute of Health (NIH), dostarczą źródeł, z których wybierać będzie można uczestników. Oczywiście, aby dało się generalizować wnioski na całą ludzkość, dla oddzielnych populacji będą potrzebne osobne kohorty.

[ 8 ] Tagging SNP / nierównowaga sprzężeń / HapMap – Fakt, że polimorfizmy znajdujące się w genomie blisko siebie są często wspólnie dziedziczone pociąga za sobą istotne konsekwencje. Dzięki temu, że niektóre polimorfizmy są ze sobą skorelowane, wiedząc, w jakim wariancie u kogoś występuje dany polimorfizm jesteśmy w stanie statystycznie – bez konieczności dodatkowego genotypowania – określić „wartość” innego polimorfizmu, który pozostaje z nim w związku korelacyjnym. W tym wypadku, zgenotypowany SNP zwany będzie „tagging SNP", natomiast warianty, które zostały za jego pomocą określone – „tagged SNPs”. Zjawisko wspólnego występowania niektórych SNPów znane jest jako nierównowaga sprzężeń.
Oczywiście, aby móc przewidzieć jeden SNP za pomocą drugiego, niezbędna jest wiedza na temat ich korelacji. Tutaj właśnie objawia się przydatność katalogów wariacji genetycznej, takich jak, najbardziej znany, Projekt HapMap. HapMap to powstały dzięki wysiłkom naukowców z wielu krajów, ogólnodostępny zbiór danych na temat m.in. współwystępowania polimorfizmów genetycznych wśród przedstawicieli populacji pochodzących z Ibadan w Nigerii, Tokio w Japonii, Pekinu w Chinach oraz Utah (uczestnicy o rodowodzie wywodzącym się z północnej lub zachodniej Europy) w USA — przyp. tłum.

Epistaza – interakcje miedzy genami

CNV [ 7 ]

Dziedziczenie epigenetyczne

Niejednorodność (heterogeniczność) choroby

Przyszłość badań genetycznych

CNV ^{[ 7 ]}