Racjonalista - Strona głównaDo treści


Fundusz Racjonalisty

Wesprzyj nas..
Zarejestrowaliśmy
152.293.988 wizyt
Ponad 1062 autorów napisało dla nas 7296 tekstów. Zajęłyby one 28776 stron A4

Wyszukaj na stronach:

Kryteria szczegółowe

Najnowsze strony..
Archiwum streszczeń..

 Co z Brexitem?
będzie drugie referendum
będzie początkiem końca UE
zyska na nim Wielka Brytania
ostatecznie wzmocni UE
dużo hałasu o nic
  

Oddano 1893 głosów.
Chcesz wiedzieć więcej?
Zamów dobrą książkę.
Propozycje Racjonalisty:
Sklepik "Racjonalisty"

Złota myśl Racjonalisty:
Kogo Zeus zechce zgubić, pozbawia go mądrości
 Nauka » Biologia » Biologia molekularna

Kopiowanie sekwencji DNA
Autor tekstu:

Dla biologii molekularnej rok 1983 był rokiem przełomowym. Wtedy właśnie Kary Banks Mullis opracował technologię umożliwiającą kopiowanie specyficznych sekwencji DNA.. To co dotychczas wymagało niejednokrotnie całych tygodni wytężonej pracy stało się nagle dziecinnie proste i ogólnodostępne. Dzięki technice nazwanej PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) możliwy stał się ogromny, a co najważniejsze szybki postęp w takich dziedzinach jak: genetyka, paleontologia, medycyna, kryminalistyka i wielu innych.

Widząc jak wielkie znaczenie dla współczesnej nauki ma reakcja PCR, warto przyjrzeć się dokładniej na czym ona właściwie polega.

PCR jest metodą pozwalającą na wybiórcze powielenie danego fragmentu DNA.Niezwykle istotnym jest, iż przy jej stosowaniu nie jest konieczne oddzielenie powielanego fragmantu od reszty sekwencji. Polimeryzacja DNA następuje dzięki odpowiednio dobranym starterom. Są one dobierane w sposób umożliwiający powielenie jedynie fragmentu DNA znajdującego się między parą starterów „forward" i „reverse".

PCR może trwać nawet kilka - kilkadziesiąt cykli, z których każdy składa się z następujących etapów:

— Denaturacja

W jej trakcie dochodzi do rozerwania wiązań wodorowych między niciami DNA. Temperatury denaturacji w poszczególnych cyklach są różne. Pierwsza denaturacja jest najdłuższa. Ma to na celu umożliwienie całkowitego rozdzielenia nici na całej długości cząsteczki. Temperatura z reguły jest zbliżona do ok. 95 oC. Zależy ona w głównej mierze od składu powielanego fragmentu oraz od wytrzymałości użytej polimerazy na wysokie temperatury. W przypadku fragmentów zawierających przewagę par C-G (cytozyna — guanina) do rozdzielenia nici należy użyć wyższej temperatury. Wymusza to użycie polimeraz termostabilnych. Średni czas denaturacji wynosi ok. 30 sekund.

— Przyłączanie starterów (Annealing)

Przyłączanie starterów jest procesem wymagającym do prawidłowego przebiegu temperatury zdecydowanie niższej niż w przypadku denaturacji. Wynosi ona z reguły około 50 oC, tym samym jest niższa od wyliczonej temperatury topnienia starterów o ok. 3 — 5°C. Gdy startery mają różne temperatury topnienia, oczywiście wybierana jest ta niższa. Zbyt niska temperatura prowadzi do powstania niespecyficznych produktów, natomiast zbyt wysoka obniża wydajność reakcji.

Przyłączanie starterów przebiega według następującego schematu:

Starter F (forward) tworzy nić komplementarną do nici 3' — 5', natomiast starter R (reverse) do nici biegnącej od 5' do 3'.

— Elongacja (Extension)

Wydłużanie łańcucha DNA zachodzi w temperaturze wyższej niż w przypadku wiązania primerów i odpowiedniej dla używanej polimerazy. Temperatura ta z dla najpopularniejszych polimeraz mieści się w granicach 70 — 800C. W trakcie tego procesu wykorzystywane są deoksyrybonukleotydy dNTP w środowisku dwudodatnich jonów magnezu. Czas potrzebny na powielenie danego fragmentu nici DNA przez polimerazę oblicza się na podstawie długości badanego fragmentu. Na prykad dla polimerazy Taq przyjmuje się średnią prędkość elongacji rzędu 1000 nukleotydów na minutę. (Jest to połowa maksymalnej prędkości powielania w optymalnych warunkach).

Prawidłowy wynik reakcji PCR jest warunkowany odpowiednim doborem starterów, środowiska reakcji oraz czasu trwania poszczególnych jej etapów.

W skład mieszaniny reakcyjnej w reakcji PCR wchodzą następujące odczynniki:

— matryca DNA — cząstka DNA, która ma zostać powielona,

bufor - tworzący środowisko rekcji, najczęściej 10 mM Tris-HCl

- startery (R i F) — jednoniciowe oligonukleotydy — łącząc się z fragmentem DNA umożliwiają jego powielanie polimerazie. Sekwencja starteru „forward" winna być zgodna z początkowym fragmentem DNA, starteru „reverse" komplementarna do końca fragmentu DNA. Użyte startery nie powinny zawierać ciągu puryn bądź pirymidyn. Ważny jest również brak odwróconych powtórzeń. Sekwencja stareterów ponadto powinna być unikalna. Starter R nie powinien być komplementarny do starteru F.

trifosforany nukleotydów (dNTPs) — mieszanina równych ilości poszczególnych trifosforanów deoksyrybonukleotydów, z których syntezowane są nowe nici DNA.

jony dwudodatnie magnezu — są wiązane przez DNA i grupy fosforanowe nukleotydów. Ponadto aktywują polimerazę.
         — termostabilna polimeraza.

Bibliografia:

B. Alberts: „Podstawy biologii komórki"

T.A.Brown: „Genomy"


 Po przeczytaniu tego tekstu, czytelnicy często wybierają też:
W obronie rozumu
Kampania uciszenia krytyków islamu przez skrajną lewicę

 Dodaj komentarz do strony..   Zobacz komentarze (5)..   


« Biologia molekularna   (Publikacja: 18-08-2009 )

 Wyślij mailem..     
Wersja do druku    PDF    MS Word

Bartosz Piekaruś
Student biotechnologii na Politechnice Śląskiej. Finalista olimpiad: ekologicznej, chemicznej.
Wszelkie prawa zastrzeżone. Prawa autorskie tego tekstu należą do autora i/lub serwisu Racjonalista.pl. Żadna część tego tekstu nie może być przedrukowywana, reprodukowana ani wykorzystywana w jakiejkolwiek formie, bez zgody właściciela praw autorskich. Wszelkie naruszenia praw autorskich podlegają sankcjom przewidzianym w kodeksie karnym i ustawie o prawie autorskim i prawach pokrewnych.
str. 6741 
   Chcesz mieć więcej? Załóż konto czytelnika
[ Regulamin publikacji ] [ Bannery ] [ Mapa portalu ] [ Reklama ] [ Sklep ] [ Zarejestruj się ] [ Kontakt ]
Racjonalista © Copyright 2000-2018 (e-mail: redakcja | administrator)
Fundacja Wolnej Myśli, konto bankowe 101140 2017 0000 4002 1048 6365